PCR

دستگاههایی بطور تجارتی تهیه می‌شوند که در آنها جایگاههای لوله‌ای با بلوک فلزی حرارت پذیر تعبیه شده است و قابل برنامه ریزی برای تغییر سریع بین دماهای لازم است. π چرخه PCR ، DNAی مورد نظر را 2π بار تکثیر می‌کند.

تاریخچه

در گذشته معمولا از روش های شیمیایی برای تولید قطعات نوکلئوتیدی استفاده می‌کردند، اما این روش ها پر زحمت بوده و نیاز به مدت زمان طولانی داشتند از سال 1980 به بعد عمدتا از روش PCR در آزمایشگاههای زیست شناسی مولکولی استفاده می‌شود.

مراحل PCR

· مرحله دناتوراسیون DNA: در مرحله اول برای مدت کوتاهی (30S) قطعات DNA را در درجه حرارت 94 درجه سانتیگراد حرارت می‌دهند تا دو زنجیره DNA از هم باز نشود.

· مرحله پرایمر و مرحله اتصال دو قطعه نوکلئوتیدی: این قطعات معمولا از 25 - 18 باز آلی تشکیل می‌شوند و می‌توانند به قطعات مکمل خود که بر روی ژن مورد نظر قرار می‌گیرند، اتصال یابند. قطعه‌ای که در آن PCR به تعداد زیاد ساخته می‌شود. ما بین دو پرایمر ساخته می‌شود. مرحله اتصال پرایمرها کوتاه بوده و حدودا 30S در دمای 65 - 30 درجه سانتیگراد صورت می‌گیرد.

· مرحله پلیمریزاسیون یا مرحله سنتز: در این مرحله با دخالت آنزیم DNA پلیمر از بر روی رشته DNA الگو. سنتز DNA با استفاده از نوکلئوتید تری فسفات‌هایی که در محلول وجود دارند، صورت می‌گیرد و برای سنتز DNA همیشه یک رشته DNA به صورت الگو و یک قطعه پلی نوکلئوتیدی به عنوان پرایمر مورد نیاز است.





ادامه PCR بعد از چرخه اول

بعد از این 3 مرحله ، چرخه اول تمام می‌شود، چرخه‌های بعدی تکرار چرخه اول است. بدین صورت به دنبال چرخه‌های متعدد PCR قطعه DNA مورد نظر بطور تصاعدی افزایش می‌یابد. یعنی از 20 چرخه ، ژن مورد نظر دارای بیش از 250 هزار خواهد بود. بنابراین روش PCR روش کارا در ازدیاد یک قطعه از DNA است.

کاربردهای مهم PCR

· تهیه نسخه‌های متعدد از یک ژن مورد نظر: گاهی برای مطالعات بیولوژی مولکولی لازم است که یک ژن با نسخه‌های نسبتا زیاد در دسترس باشد. بدین منظور می‌توان با استفاده از روش PCR ژن مورد نظر را در مقایسه با بقیه ژن‌ها تکثیر نمود.

· بررسی حضور یا عدم حضور یک ژن: با استفاده از این روش می‌توان تشخیص داد که آیا یک ژن در یک سلول حضور دارد یا نه؟ گاهی نیز از این مطالعات برای بررسی وجود ژنهای مختلف باکتری‌ها یا ویروس‌ها در بدن افراد استفاده می‌کنند.

· تشخیص بیماری‌های قبل از تولد: با استفاده از PCR و بکار گرفتن پرایمرهای مربوط به یک ژن بیمار و پرایمرهای مربوط به ژن سالم آلل آن می‌توان از تولد کودکان دارای بیماری‌های ژنتیکی جلوگیری کرد. برای این کار بعد از لقاح تخمک در آزمایشگاه ، بعد از رسیدن تخمک به حالت 10 سلولی ، یک سلول را جدا کرده و با استفاده از پرایمرها از ژن مورد نظر PCR صورت می‌گیرد، اگر بعد از PCR منحصرا ژن سالم تکثیر پیدا کرد، این مفهوم هموزیگوت بودن سلول‌های جنینی و سالم بودن آنهاست.

· تعیین جنسیت جنین: معمولا چند تخمک با چند اسپرم در آزمایشگاه لقاح می‌یابند و سپس اجازه تکثیر به سلول تخم داده و با رسیدن تخم به مرحله ده سلولی ، یکی از سلول‌ها را جدا کرده و بوسیله پرایمرهای ویژه مربوط به کروموزوم y مورد PCR قرار می‌گیرد. کروموزوم y منحصرا در سلول‌های نر دیده می‌شود. اگر قطعه تولید نشده در PCR بوسیله الکتروفورز و بطور دقیق‌تر توسط ساترن بلوتینگ تشخیص داده شد، جنین از نوع پسر و در غیر این صورت دارای کروموزوم‌های xx خواهد بود.

تشخیص بیماریها

کشت میکروبها که جهت تشخیص بیماریهای عفونی در اکثر آزمایشگاهها بکار می‌رود. زمان‌بر بوده و ثانیا باعث افزایش تعداد میکروب‌های بیماریزا و غیر بیماریزا در شرایط آزمایشگاهی می‌گردد. امروزه در برخی آزمایشگاهها روش PCR جایگزین روش‌های کشت شده است. یعنی قطعه‌ای از ژن مربوط به میکروب بیماریزا مورد شناسایی قرار گرفته و پرایمرهای مربوط تولید می‌شوند، با استفاده از این پرایمرها می‌توان تشخیص داد که آیا ویروس ایدز در داخل بدن وجود دارد یا نه؟




مشکل PCR و راه حل آن

اشکال PCR ، آلودگی نمونه‌های مورد بررسی توسط قطعات DNA خارجی است. اگر قبلا در داخل دستگاهی PCR یک نمونه انجام گرفته باشد. و ذره کوچکی از آن در داخل دستگاه باقی بماند. در PCR نمونه بعدی مشکل ایجاد خواهد کرد. برای رفع مشکل امروزه از ظروف یکبار مصرف استفاده می‌شود. کلیه ظروف قبل از استفاده اتوکلاو می‌شوند تا سلول‌ها و مولکولهای موجود در آنها ، حتی‌الامکان غیر فعال می‌شوند.

یکی از روش‌های پیشنهادی انجام PCR داخلی یا Nestied PCR است. از این روش با استفاده از دو پرایمر قطعه‌ای از DNA را تکثیر می‌دهند و سپس قطعه‌ای دیگر در داخل DNA‌های تکثیر شده PCR می‌شود. بدین صورت احتمال آلودگی کاهش می‌یابد.

روش‌هاي تغييريافته PCR و كاربرد اين روش‌ها در شناسايي و درمان


واكنش زنجيره‌هاي پليمراز (PCR) روشي است براي تكثير اختصاصي قطعات DNA كه نخستين بار در سال 1985 گزارش شد. در اين روش قطعه‌اي از DNA به طور انتخابي با به‌كارگيري دو پرايمر اوليگونوكلوئوتيدي و آنزيم پليمراز Tag مي‌توان تا ده هزار برابر تكثير كرد. هريك از اين دو پرايمر به رشته‌هاي مخالفشان در روي DNA هدف متصل شده و مكان آنها به‌گونه‌اي است كه سنتز زنجيره DNA توسط آنزيم پليمراز تنها در ميان دو پرايمر انجام مي‌گيرد.


از آنجا كه زنجيره‌هاي تازه ساخته شده خود مكمل پرايمرها است، اين چرخه مي‌تواند پس از يك مرحله واسرشته شدن زنجيره‌هاي DNA از هم تكرار شود. به عبارتي PCR روشي است براي يك برنامه دوره‌اي مشتمل براي تكرار گرم و سرد كردن و DNA به‌كمك يك آنزيم DNA پليمراز مقاوم به گرما و يك جفت پرايمر تحت تكثير انتخابي قرار مي‌گيرد و از طريق اين روش DNA به صورت تصاعد هندسي زياد مي‌شود. امروزه روش PCR جايگاه بسيار مهمي را در جنبه‌هاي مختلف مهندسي ژنتيك، بيولوژي مولكولي، ميكروب‌شناسي تشخيصي تشخيص سرطان و بيماري‌هاي ژنتيك، تشخيص هويت، جرم شناسي (پزشكي قانوني جهت تشخيص منشأ نمونه اسپرم، خون و ...) تعيين ترادف، باستان‌شناسي، مطالعات تكاملي موجودات و ... پيدا كرده است. كاربرد بيشتر و دقيق‌تر تكنيك PCR در تشخيص، روش‌هاي تغيير يافته‌اي از آن به وجود آمده است كه به تعدادي از آنها اشاره مي‌شود.


مالتيپلكس پي سي آر (Multiplex-PCR)
يكي از روش‌هاي تغييريافته PCR است كه در آن تنها يك جايگاه ژني مورد بررسي قرار مي‌گيرد، با استفاده از پرايمرهاي مختلف مي‌توان چندين جايگاه را مورد بررسي قرار داد و از چندين جفت پرايمر اختصاصي جهت تكثير استفاده مي‌شود. كاربردهاي اين روش مي‌تواند شامل موارد زير باشد:
1) بخش‌هاي بزرگي از يك DNA (هدف)، جهت جست‌وجوي تغييرات مي‌تواند بررسي شود. براي مثال كشف نقص‌ها در بيماري ديستروفي عضلاني روشن يا كشف بخش‌هاي مختلف IS6110 و IS986 در مايكروباكتريوم توبر كلوزيس عامل بيماري سل،
2) بخش‌هاي غيرمربوط به هم در ژنوم هدف مي‌تواند مورد آزمايش واقع شود و
3) مي‌توان از طريق اين روش با پرايمرهاي مختلف به جست‌وجوي عوامل مختلف پرداخت، مانند شناسايي عوامل شايع مننژيت. اين روش بيشتر براي شناسايي جايگاه‌هايي از ژن‌ها به كار مي‌رود كه انواع زيادي از جهش در آنها به وقوع مي‌پيوندد.


آرتي-پي‌سي آر (RT-PCR)
اين روش به PCR نسخه‌برداري معكوس نيز معروف است كه ماده اوليه در آن RNA است. اولين مرحله در اين روش تبديل RNA به DNA (DNAاي كه مكمل توايس‌هاي mRNA است) توسط آنزيم نسخه‌بردار معكوس صورت مي‌گيرد (RT). برخي از موجودات مانند برخي از ويروس‌هاي RNAدار، ژنومشان تنها از RNA ساخته شده است. بعضي از ويروس‌ها مانند ويروس هپاتيت B هرگز به شكل DNA مابين در اثر آنزيم نسخه‌بردار معكوس درنمي‌آيد. آنزيم نسخه‌بردار معكوس (RT) در اين روش از "Avian Myeloblastosis Virus (AMV)" و "Moloney Murine Leu Kemia Virus (MMLV) " به‌دست آمد.
كاربرد اين آنزيم به‌دليل آن‌كه آنزيم به حرارت حساس بود در ابتدا پايين بود ولي با كشف باكتري به نام "ترموس ترموفيلوس" يك DNA پليمر از مقاوم به نام (Tth) بهبود يافت كه در حضور يون Mn+2 داراي فعاليت نسخه‌برداري معكوس است و در دماي 72 درجه سانتيگراد توسط اين آنزيم از روي RNA، DNA ساخته مي‌شود و سپس Mn+2 اضافي توسط اتيلن گليكول تترااستيك اسدي (EGTA) حذف مي‌شود و سپس اين آنزيم از DNAاي كه خود ساخته استفاده و آن را تكثير مي‌كند.


آرمز پي‌سي‌آر (ARMS-PCR)
اين روش تكثيري قدرتمند براي مشخص كردن جهش‌هاي نقطه‌اي است. در اين روش از پرايمرهاي جهش يافته و طبيعي در دو لوله جداگانه استفاده مي‌شود. اگر عمل پليمريزاسيون در لوله حاوي پرايمر طبيعي انجام شود، نشان‌دهنده نبود جهش نقطه‌اي در باز مورد نظر است و اگر عمل پليمريزاسيون در لوله‌ حاوي پرايمر جهش يافته انجام شود، نشان‌دهنده حضور جهش نقطه‌اي در باز مورد نظر است. اين روش نام‌هاي ديگري نيز دارد از جمله MAMA-PCR مخفف Amplificatin Multation Assay Mismatch و COP-PCR مخفف Competitive Oligonucleotide Primming.


نستد پي‌سي‌آر (Nested-PCR)
در اين روش از دو جفت پرايمر استفاده مي‌شود، طوري كه جفت دوم در بني جفت اول جاي مي‌گيرد. در اين روش ابتدا پرايمر بيروني توالي هدف در طول 30-15 چرخه تكثير مي‌شود، سپس محصول PCR حاصل به لوله‌اي ديگر منتقل مي‌شود و به‌عنوان الگو و با استفاده از جفت پرايمر داخلي مرحله دوم PCR انجام شده و ترادف كوچكتري از DNA كه درون PCR اولي است، به اندازه 40-15 چرخه تكثير مي‌شود.
مزاياي اين روش تغيير يافته PCR عبارت است از: 1) نياز به پروب (كاوشگر) و تأييدهاي بعدي كمتر است، 2) حساسيت در اين روش به ميزان زيادي بالاتر است و 3) به دليل انتقال محصول PCR دور اول به لوله جديد، ممانعت كننده‌ها رقيق مي‌شود. اين روش در تعيين جنسيت جنين در سه ماهه اول بارداري استفاده شده و از اين طريق توانسته‌اند بيماري‌هاي وابسته به جنس را تعيين كرده و از تولد كودكان بيمار جلوگيري كنند.
همچنين ويروس "سيتومگالوويدوس" كه مي‌تواند سبب ناشنوايي در 1% از كودكان شود، توسط اين روش تشخيص داده شده و امكان درمان زودهنگام از اين طريق امكان‌پذير است. جنين‌هاي مبتلا به سندروم داون نيز در مرحله بارداري مادر با اين روش تشخيص داده شدند.


Real-Time PCR
به علت ورود نسل جديدي از ترموسايكلرها با سيستم فلورومتري كه اجازه پايش پيوسته خاصيت فلوئورسانس محصول PCR در زمان جمع شدن را مي‌دهد، اين روش ابداع شد. در اين روش از كاوشگرها يا پروب‌هاي هيبريداسيون نشان‌دار شده با رنگ‌هاي فلورسانس در انتهاي 5 يا 3 استفاده مي‌شود. كه امكان پايش پيوسته محصول PCR را بدون جداسازي آنها در روش‌هاي الكتروفورز در ژل آگاروز يا ژل پلي آكريل آميد مي‌دهد. اين سيستم در سال 1992 كشف شد. اين روش به دليل كاهش زمان سيلك‌هاي PCR، حذف مرحله Post-PCR و كاربرد نشانگرهاي فلوروژنيك و روش‌هاي حساس آشكارسازي تابش آنها باعث افزايش سرعت اين سيستم نسبت به سيستم PCR معمولي شده است. سازندگان و كاربران اين روش سعي مي‌كنند محصول PCR كوچك‌تر طراحي كنند تا سرعت افزايش يابد اما تجربه نشان داده كه كاهش اندازه محصول لزوماً بازده PCR را بهينه نمي‌كند. البته اين روش داراي معايبي نيز است از جمله مي‌توان به عدم ناتواني در مشخص كردن اندازه محصول بدون باز كردن سيستم و ناسازگار بودن برخي پلت فرم‌ها با شيمي برخي رنگ‌هاي فلورژنيك اشاره كرد. براي شناسايي بسياري از ويروس‌هاي عامل بيماري‌هاي انسان از اين روش استفاده شده است.